| Заболевание | Распространенность |
| Аутизм | 1 случай из 150 пораженных детей |
| Шизофрения в детском возрасте | 1 случай из 10 000 пораженных детей |
| Маниакально-депрессивный психоз | 2,4 миллиона человек в США данные по странам СНГ уточняются |
| Пониженная обучаемость | 4,5 миллиона детей в США данные по странам СНГ уточняются |
| Младенческая энцефалопатия | Нет данных |
| Средняя и тяжелая степень задержки умственного развития | 7 миллионов человек в США данные по странам СНГ уточняются |
Связь: Этот e-mail адрес защищен от спам-ботов, для его просмотра у Вас должен быть включен Javascript
Резюме
Мутации в метил-CpG-связывающем белке 2 (MECP2) гена вызывают синдром Ретта (РТТ), нарушение умственного развития, характеризующееся потерей речевых и моторных навыков в период раннего детства. Мы вывели мышей с процессирующей мутацией, подобной той, которую обнаруживают у пациентов с РТТ. Эти мыши выглядели здоровыми и проявляли нормальные моторные функции в течение примерно шести недель, однако затем у них развилось прогрессирующее неврологическое заболевание, имеющие многие признаки РТТ: тремор, моторные нарушения, гипоактивность, поведение, связанное с повышенной тревожностью, судороги, кифоз и стереотипные движения передних конечностей. Кроме того, мы показали, что, хотя у этих мышей процессированный белок MeCP2 нормально локализуется в гетерохроматических районах in vivo, гистон H3 является гиперацетилированным, что доказывает, что архитектура хроматина является ненормальной, и экспрессия гена может неправильно регулироваться в данной модели синдрома Ретта.
Введение
Классический синдром Ретта (РТТ), обнаруживаемый почти исключительно у девочек, протекает по прогнозируемой схеме, начиная с 6-18 месяцев выраженного нормального развития, при этом в течение данного периода дети достигают различных рубежей развития (Hagberg et al., 1983). Затем пораженные дети оказываются не в состоянии приобретать новые навыки и вступают в период регрессии, в течение которого они утрачивают моторные и речевые навыки. С течением времени отмечается целый ряд признаков: нарушения походки, приостановка роста головы и тела, сколиоз/кифоз, аутистическое поведение, судороги, пролонгированные интервалы QT и нарушения дыхания, такие как гипервентиляция и апноэ (Hagberg et al., 1983; Trevathan, 1988). Одним из особых отличительных признаков синдрома Ретта являются стереотипные движения рук, замещающие при этом целенаправленные движения рук (Hagberg et al., 1983). Варианты синдрома Ретта, которые соответствуют многим, но не всем критериям классического РТТ, включая более мягкое и более тяжелое течение. Например, пациенты с более мягким вариантом заболевания могут сохранять речевые или моторные функции в некоторой степени или иметь тело и головной мозг нормального размера, в то время как у индивидов, страдающих тяжелыми формами болезни, отсутствует период выраженного нормального развития (Hagberg and Skjeldal, 1994).
Идентификация мутаций в метил-CpG-связывающем белке 2 (MECP2) гена как причины возникновения синдрома Ретта подразумевала эпигенетическое направление в исследовании этого комплексного поведенческого фенотипа (Amir et al., 1999). В настоящее время мутации выявлены приблизительно у 80% пациентов с классическим РТТ и у немного меньшего количества пациентов с вариативными случаями, что подтверждает тот факт, что мутации MECP2 являются основной причиной возникновения синдрома Ретта, а вариативные формы, несомненно, являются частью одной и той же нозологической формы (Bourdon et al., 2001; Van den Veyver and Zoghbi, 2001; Zappella et al., 2001). Ген MECP2 является Х-сцепленным и зависит от инактивации Х-хромосомы (ИХХ) у женщин и, следовательно, паттерн ИХХ может влиять на фенотипический результат мутаций. Например, искажение ИХХ наблюдалось у нескольких женщин, являющихся носителями мутаций, вызывающих РТТ, но не обнаруживающих симптомов заболевания или страдающих только незначительной умственной отсталостью (Amir et al., 2000; Bienvenu et al., 2000; Hoffbuhr et al., 2001; Villard et al., 2000; Wan et al., 1999). У мужчин с мутациями MECP2, известных как вызывающие возникновение классического синдрома Ретта у женщин, развивалась тяжелая форма энцефалопатии новорожденных, ведущая к смерти в течение 1-2 года жизни (Hoffbuhr et al., 2001; Villard et al., 2000; Wan et al., 1999). С другой стороны, у мужчин с мутациями MECP2, которые имеют весьма легкие последствия для женщин, наблюдались симптомы, подобные симптомам РТТ и/или психоз (Cohen et al., 2002; Imessaoudene et al., 2001; Meloni et al., 2000; Orrico et al., 2000).
Ген MECP2 кодирует белок из 486 аминокислот, который имеет три распознаваемых домена. Метилцитозин-связывающий домен (MBD) является промежуточным звеном при связывании с метилированными CpG-динуклеотидами, обычно встречающихся в гетерохроматических районах хромосом (Lewis et al., 1992; Nan et al., 1993,1996). MeCP2 также содержит транскрипционный репрессивный домен (TRD), который, как было выявлено, взаимодействует с различными комплексами ко-репрессоров, такими как Sin3a, c-Ski, и N-CoR (Kokura et al., 2001; Nan et al., 1998). Деацетилазы гистонов (HDAC) этих комплексов содействуют транскрипционной репрессии посредством ремоделирования структуры хроматина. Третий домен карбоксильного конца MeCP2 гомологичен членам семейства транскрипционных факторов forkhead, однако эта гомология находится за пределами консервативного ДНК-связывающего домена (Vacca et al., 2001). Поскольку MeCP2 присутствует во многих тканях, связывается с метилированными CpG, которые в избытке находятся в геноме, и взаимодействует с комплексами гистоновых деацетилаз, считается, что он действует как общий транскрипционный репрессор. Присутствие различных доменов в белке MeCP2 наводит на мысль, что положение и тип мутации может определять то, какой функциональный аспект(ы) белка затронуты и, таким образом, влияют на фенотипический результат.
Трудно понять, каким образом дисфункция этого белка, которая, как можно спрогнозировать, может вызвать дерепрессию сотен или тысяч генов, приводит, главным образом, к неврологическим фенотипам. Для исследования этого парадокса и понимания механизма возникновения заболевания оказываются полезными экспериментальные модели на животных. Две группы вывели мышей с нулевой мутацией Mecp2. В возрасте около 5 недель у самцов мышей была выявлена гипоактивность, сжимающие движения задними конечностями, дрожь, снижение массы тела и головного мозга, уменьшение объема нейронов, затем последовала смерть между 6 и 12 неделей жизни (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001). Гетерозиготные самки с нулевой мутацией выжили, сходные симптомы проявились у них позже при жизни; однако подробностей об их поведенческих и неврологических отклонениях не сообщается. Принимая во внимание преждевременную смерть самцов с нулевой мутацией, болезнь проявилась у них в более тяжелой форме, чем у новорожденных самцов с мутациями MECP2, вызывающими РТТ.
Мы пришли к заключению, что для наблюдения РТТ-подобного фенотипа у мышей и обеспечения жизнеспособности у трансгенных самцов необходимо сгенерировать мутацию, достаточную для возникновения классического РТТ у самок, но, в то же время, они могли бы сохранить частичное функционирование. Итак, мы показываем, что самцы мышей с процессированным MeCP2 выживают и у них обнаруживают многие симптомы, выявленные у самок с синдромом Ретта. Кроме того, у трансгенных мышей обнаруживается повышенный уровень ацетилирования гистона H3, предоставляя in vivo доказательство роли MeCP2 в модификации архитектуры хроматина.
Результаты
Выведение Мышей, Экспрессирующих Процессированный Белок MeCP2
Для построения модели синдрома Ретта на мышах мы использовали направленное воздействие на гены с целью внедрения процессирующей мутации в мышиный ген Mecp2. Поскольку мы хотели, чтобы самцы мышей выжили, мы искали способ, позволяющий произвести мутацию, приводящую не к таким тяжелым последствиям, как при нулевом аллеле. Таким образом, мы поместили преждевременный терминирующий кодон за кодоном 308, который находится между процессирующей мутацией у мужчин, которая отвечает за возникновение энцефалопатии новорожденных и смерть (G269fsX288) и мутацией, вызывающей тяжелые формы умственной отсталости, сопровождаемые судорогами и атаксией (Q406X) Meloni et al., 2000; Wan et al., 1999). Это смоделированное процессирование сохраняет MBD, TRD и сигнал ядерной локализации, но практически устраняет С-концевую треть кодирующей области. Вероятно, данная мутация может способствовать возникновению полного спектра симптомов РТТ, поскольку многие пациенты с классическим РТТ имеют процессирующие мутации в данной области и за ней (Shahbazian and Zoghbi, 2001). Поскольку терминирующий кодон процессировал кодирующую последовательность Mecp2 за кодоном 308 (Рисунок 1А), мы будем именовать этот мутированный аллель Mecp2XB. Саузерн-блотинг анализ клонов эмбриональных стволовых клеток (ES) подтвердил, что планируемое явление рекомбинации произошло у части клонов (Рисунок 1В). Когда были выведены трансгенные мыши, мы подтвердили наличие процессированной формы белка MeCP2 в головном мозге, используя два антитела, распознающих различные антигенные детерминанты MeCP2 (Shahbazian et al., 2002). Иммуноблоттинговый анализ показал, что антитело MeCP2C17, специфичное для С-концевой антигенной детерминанты, которое удалено у мышей с Mecp2308/y, распознано в непроцессированном белке (74 kDa) у немутантных мышей, но не найдено у трансгенных. Антитело MeCP2N15, распознающее антигенную детерминанту в аминоконцевой половине MeCP2, которая сохраняется при процессированиии, выявило наличие непроцессированного белка у немутантного животного, при этом выявило процессированный белок с массой 52 kDa у трансгенных животных (Рисунок 1С). Кроме того, окрашивание мозговой ткани коммерческими антителами до карбоксильного конца MeCP2 подтвердило отсутствие непроцессированного белка у трансгенных мышей (Рисунок 1D). Подобные участки, окрашенные антителами MeCP2N15, показали, что белок трансгенных мышей нормально локализуется в гетерохроматических районах (Рисунок 1D). Это не является неожиданностью, принимая во внимание тот факт, что метилцитозин-связывающий домен и сигнал ядерной локализации остаются в процессированном белке.
Основные Симптомы у Мышей Mecp2308/y
У самцов трансгенных мышей не было выявлено выраженных отклонений до шестинедельного возраста, когда стало возможным ощутить легкий тремор, если подвесить мышь за хвост. Этот тремор усиливался с возрастом, и к четырем месяцам он был заметен уже при зрительном наблюдении. С пятимесячного возраста у сорока процентов мышей развился кифоз, возможно, из-за прогрессирующей моторной дисфункции (Рисунок 2А). С восьмимесячного возраста шерсть трансгенных мышей выглядела заметно более жирной и взъерошенной, чем шерсть однопометных немутантных мышей. У некоторых трансгенных мышей наблюдались спонтанные поведенческие судорожные мышечные движения и судорожные припадки. Синхронные электроэнцефалографические (ЭЭГ) и видео записи одного из этих эпизодов, на которых обнаруживается поведенческая блокировка, сопровождаемая серией повторяющихся генерализованных судорожных мышечных движений, сопряженных с высокоамплитудными двусторонними корковыми разрядами пиков и волн на ЭЭГ (Рисунки 2В и 2С; также см. дополнительный фильм S1 он-лайн на http://www.neuron.Org/cgi/content/full/35/2/243/ DC1). Большинство мышей Mecp2308/y дожили, как минимум, до одного года, однако около 10 процентов умерли по неизвестным причинам в возрасте около 10 месяцев. Масса тела находилась в пределах нормы, мыши были способны к размножению. У гетерозиготных самок мышей симптомы варьировались и наблюдались в более мягкой форме даже в возрасте одного года.
Нарушение Моторных Функций и Активности у Mecp2 Трансгенных Мышей
Сначала мы оценили моторные функции у мышей Mecp2308/y, поскольку у пациентов с синдромом Ретта имеются различные моторные нарушения. Чтобы определить, нарушена ли моторная координация у трансгенных мышей, мы провели анализ их показателей, используя стандартную парадигму для аппарата для проведения теста ускоряющегося вращающегося стержня, но не смогли выявить какую-либо недостаточность у мышей Mecp2308/y (p = 0,83) (Рисунок 3А). Для повышения чувствительности теста мы удалили держатели с поверхности стержня, покрыли стержень клейкой лентой и оценили способность каждого животного двигаться вперед и назад. При проведении этого модифицированного теста вращающегося стержня мы обнаружили у мышей Mecp2308/y незначительное, но статистически значимое ухудшение их способности удерживаться на стержне (p = 0,04) (Рисунок 3B).
Рисунок 1. Поколение Мышей, Продуцирующих Процессированную Версию MeCP2.
(А) Стратегия таргетирования преждевременного терминирующего кодона (TAA) в кодирующей области Mecp2. Терминирующий кодон был вставлен вместе с кассетой, резистентной к неомицину непосредственно за областью транскрипционной репрессии.
(В) Саузерн-блоттинг анализ эмбриональных стволовых клеток ДНК, расщепленных рестриктазой EcoRV и гибридизированных с 5' и 3' зондами, показал, что планируемое явление рекомбинации произошло.
(С) Интактный (74 kDa) белок MeCP2 виден при вестерн-блоттинге экстрактов из трансфектированных клеток (POS) и клеток немутантных мышей (WT), но не клеток трансгенных мышей при зондировании с применением антител MeCP2C17, распознающих аминокислоты 388-404. Антитела MeCP2C15, распознающие аминокислоты 164-178, определяют непроцессированный MeCP2 в экстрактах из трансфектированных клеток и клеток немутантных мышей, и определяет процессированный белок массой 52 kDa в экстрактах из клеток трансгенных мышей.
(D) Окрашивание мозговой ткани С-концевым антителом подтверждает, что интактный MeCP2 отсутствует в мозге трансгенных мышей (показана область CA3 гиппокампа). Процессированный белок, распознанный антителами MeCP2N15, нормально локализуется в гетерохроматических районах. Масштабная линейка на рисунке (D) составляет 25 мкм и применима ко всем изображениям в данном наборе.
Сокращения: MBD – метилцитозин-связывающий домен; TRD – домен транскрипционной репрессии; NLS – сигнал ядерной локализации.
Для дальнейшего исследования дефекта моторной координации мы провели несколько других испытаний. При проведении теста вертикальной оси мышей помещают на один конец горизонтального стержня, который поднимают до вертикального положения так, что мышь оказывается на конце стрежня. Фиксируется способность мышей удерживаться на стержне или взбираться вверх и вниз по стрежню (Paylor et al., 1998). Mecp2 трансгенные мыши чаще падали со стрежня, чем однопометные немутантные мыши (p = 0,0007) (Рисунок 3C). При проведении теста «подвешенной проволоки» оценивается способность мышей удерживаться на проволоке с помощью передних лап (Paylor et al., 1998). В то время как немутантные мыши, в целом, удерживались максимум в течение 60 секунд, мыши Mecp2308/y были склонны падать раньше (p = 0,01) (Рисунок 3D). Мы также проанализировали способность мышей удерживаться на тонком (диаметром 0,9 см) горизонтальном деревянном штифте в течение, как максимум, 120 секунд. В возрасте 5 месяцев все немутантные животные были способны удерживаться на штифте максимальное время, при этом они часто могли свободно ходить по нему. И наоборот, трансгенные мыши быстро теряли равновесие и падали со штифта (p = 0,01) (Рисунок 3E; см. также видеозапись в дополнительном фильме S2 он-лайн на http://www.neuron. org/cgi/content/full35/2/243/DC1). Чтобы определить, были ли моторные расстройства проявлением мышечной слабости, мы измерили силу схвата передних лап, но не выявили статистически значимой разницы в силе (p = 0,19) (Рисунок 3F). Пациенты с РТТ обычно достигают нормальных показателей моторных функций в течение начального периода развития, но впоследствии утрачивает эти навыки. Таким образом, мы попытались выяснить, проявляются ли нормальные моторные навыки также и у мышей Mecp2308/y в раннем возрасте. Мы протестировали молодых (8-9 недель) и старых (35-36 недель) самцов 129/SvEv с чистой наследственностью на штифте и обнаружили, что их показатели ухудшались только в старшем возрасте (p < 0,0001) (Рисунок 3G). Самки с гетерозиготной мутацией Mecp2 показали на штифте те же результаты, что и немутантные мыши, даже в возрасте 35-39 недель (p = 0,34) (Рисунок 3G). Тест «подвешенной проволоки» оказался более чувствительным анализом моторных дефектов, поскольку самцы более раннего возраста (8-9 недель) падали чаще, чем немутантные мыши (p = 0,01) (Рисунок 3H). Мы проанализировали таким образом самцов мышей в возрасте 5-6 недель и обнаружили, что их показатели не отличаются от показателей немутантных мышей (p = 0,95) (Рисунок 3H). У самок Mecp2308+ также были зафиксированы показатели на уровне немутантных мышей в возрасте 5-6 недель, однако эти показатели ухудшились с возрастом (35-39 недель) (p = 0,05) (Рисунок 3I).
Рисунок 2. Кифоз и Спонтанные Миоклонические Судороги у Мышей Mecp2308/y
(А) В возрасте 7 месяцев у мышей Mecp2308/y (MUT) часто развивался кифоз, в то время как у однопометных немутантных мышей (WT) сохранялась нормальная осанка.
(В) Двусторонние корковые разряды наблюдались во время спонтанных миоклонических судорог у взрослой Mecp2 трансгенной мыши. Каждый разряд пик-волна сопровождался большим судорожным припадком, распространявшийся на голову и передние конечности. Нормальное поведение и ЭЭГ ритмы восстановились сразу же после разряда.
(С) В межприпадочном периоде у трансгенных мышей был отмечен нормальный рисунок ЭЭГ. См. дополнительный фильм S1 он-лайн – видеозапись миоклонического приступа.
Мы оценили двигательную активность с помощью теста открытого поля. В целом, у мышей Mecp2308/y отмечается более низкая активность, если измерить общее пройденное расстояние (p = 0,002) и время, потраченное на движение (p = 0,001). Более детальный анализ показал, что у Mecp2308/y трансгенных мышей отмечается нормальная двигательная активность в течение первого десятиминутного интервала, и сниженная активность в течение второго и третьего десятиминутного интервала (p значения < 0,002) (Рисунки 4A и 4B). Скорость движения трансгенных и немутантных мышей в открытом поле была сходная (в целом, p = 0,21) (Рисунок 4C). Хотя общее количество вертикальных стоек (вертикальная активность) не была существенно ниже у Mecp2 трансгенных мышей (p = 0,145), трансгенные мыши все же реже вставали на задние лапы в течение последнего десятиминутного интервала (p = 0,014) (Рисунок 4D). По этим совместным данным можно предположить, что трансгенные животные либо быстро устают, либо у них имеется патологическая исследовательская реакция на новую среду. Последующие тесты показали, что быстрота уставания не симптоматична для трансгенных мышей (в возрасте, в котором проводились испытания), и, следовательно, это не является причиной снижения активности в открытом поле (см. ниже).
Отношение расстояния, пройденного в центре поля к общему расстоянию, может использоваться в качестве критерия оценки поведения, связанного с тревожностью (Paylor et al., 1998). Немутантные мыши исследовали центр открытого поля чаще, чем трансгенные мыши (p = 0,012). Соотношение расстояние, пройденное в центре/общее расстояние, было схожим у Mecp2 трансгенных мышей и немутантных мышей в течение первого десятиминутного интервала (p = 0,77), однако у немутантных мышей отмечено большее соотношение расстояние, пройденное в центре/общее расстояние в течение двух последних анализируемых интервалов (p = 0,03 и 0,0006, соответственно). В то время как у немутантных мышей активность в центре поля со временем повышалась (p < 0,0001), объем проявлений исследовательского поведения трансгенных мышей в центре открытого поля в течение эксперимента не изменялся (p = 0,614) (Рисунок 4E). Следовательно, результаты поведения трансгенных мышей в ходе теста открытого поля могли отражать повышенную тревожность.
Рисунок 3. Мыши Mecp2308/y Демонстрируют Прогрессирующее Снижение Моторных Навыков, Однако Обладают Нормальной Силой
(А) На ускоряющемся вращающемся стержне показатели трансгенных мышей (n = 10) были подобны показателям немутантных мышей (n = 12).
(В) Когда аппарат с вращающимся стержнем был модифицирован таким образом, что с его поверхности были удалены захваты, трансгенные мыши (n = 9) продемонстрировали ухудшение способности удерживаться на стержне, по сравнению с немутантными мышами (n = 12).
(С-Е) У трансгенных мышей (n = 24) было отмечено ухудшение способности удерживаться на стержне, который менял положение с горизонтального на вертикальное и (D) повисать на тонкой металлической проволоке на передних лапах, по сравнению с немутантными мышами (n = 19). В то время как максимальное время, в течение которого немутантные мыши (n = 6) держались на деревянном штифте, составляло 2 минуты, мыши Mecp2308/y (n = 7), как правило, падали (Е).
(F) Данные отклонения не являлись следствием мышечной слабости, поскольку сила схвата была нормальной.
(G) Хотя показатели молодых самцов на штифте находились в норме, более старшие самцы демонстрировали худшие показатели, а показатели гетерозиготных самок того же возраста оставались в норме.
(H) Самцы показывали нормальные результаты на подвешенной проволоке в возрасте 5-6 недель, но с возрастом их показатели ухудшались.
(I) Гетерозиготные самки висели столь же долго, что и немутантные мыши в возрасте 5-6 недель, однако в 35-39 недель они не были на это способны.
Сокращения: WT – немутантные; MUT – трансгенные; HET – гетерозиготные; FDx – движения вперед в день х; BDx – движения назад в день х.
Одним из уникальных симптомов у пациентов с синдромом Ретта являются стереотипные движения в виде сжимания рук. Чтобы определить, имеется ли у мышей аналог этого симптома, мы оценивали движения передних конечностей мышей, когда их подвешивали за хвост. В отличие от немутантных мышей, передние конечности которых, как правило, находились в покое, мыши Mecp2308/y совершали быстрые стереотипные движения передними конечностями, часто сводя их вместе и иногда держа их вместе в течение нескольких секунд (см. дополнительный фильм S3 он-лайн на http//:www.neuron. org/cgi/content/iull/35/2/243/DC1). Мы также наблюдали такие стереотипные действия у трансгенных мышей, когда они не были спровоцированы и находились в своих клетках.
Принимая во внимание фенотипическую изменчивость у самок с мутациями MECP2 (которые варьируются от отсутствия заболевания до синдрома Ретта), мы определили, проявляли ли самки мышей также изменчивость в фенотипе. Для проведения этого анализа исследователь, не имеющий информации о генотипах группы самцов и самок мышей, оценивал два признака: стереотипные движения передних лап и тремор. Мыши 129/SvEv с чистой наследственностью были использованы для устранения какого-либо генетического эффекта. Оба признака имелись у всех самцов трансгенных мышей (13/13), и не проявились ни у одного из немутантных самцов (0/15). У гетерозиготных самок стереотипные движения передних лап обнаружились у 69% (9/13) и у 62% (8/13) был выявлен тремор. Ни у одной из немутантных самок не было тремора (0/16), однако у одной из них были отмечены стереотипные движения передних лап. Это единственное расхождение, вероятно, объясняется те фактом, что, когда немутантных мышей подвешивают за хвост, они часто пытаются схватить свои задние лапы, что может быть ошибочно оценено как неуправляемые движения передних лап.
Аномальное Социальное Взаимодействие Мышей с Процессированным MeCP2
Чтобы выявить наличие аналога аутистическому поведению, часто наблюдаемому у пациентов с синдромом Ретта, мы использовали тест с трубкой, с помощью которого мы оценивали социальные взаимодействия, такие как доминирование в сообществе у мышей (Lindzey et al., 1961). В ходе теста с трубкой двух мышей помещают в противоположные концы акриловой трубки и, как правило, одна из мышей отступает, когда другая приближается. Интересно, что когда пару немутантным мышам составляли мыши Mecp2308/y, немутантные мыши отступали перед трансгенными мышами в большинстве случаев (p = 0,003) (Рисунок 5A). Неспособность мышей Mecp2308/y отступить перед немутантными мышами нельзя объяснить неспособностью мутантов двигаться назад, так как одна из немутантных мышей заставляла всех трансгенных мышей отступить. Существуют три варианта объяснения этого результата. (1) Трансгенные мыши вынуждали немутантных мышей отступить, хотя такая возможность представляется маловероятной, учитывая моторные нарушения и гипоактивность мутантов. (2) Мутанты не в состоянии воспринять ощущение социальной угрозы средней степени со стороны немутантных мышей и не отступают. (3) Немутантные мыши активно избегают трансгенных мышей.
Рисунок 4. Mecp2 Трансгенные Мыши Менее Активны и Демонстрируют Повышенный Уровень Тревожности.
(А-С) В ходе теста «открытого поля» на двигательную активность мыши Mecp2308/y (n = 24) проходили меньшее расстояние и (В) затрачивали меньше времени на движение, но (С) двигались с той же скоростью, что и немутантные мыши (n = 19).
(D) Также трансгенные мыши реже вставали на задние лапы.
(Е) Со временем активность немутантных мышей в центре открытого поля возрастала, у трансгенных мышей этого не наблюдалось, что наводит на мысль, что у них может повышаться уровень тревожности.
Сокращения: WT – немутантные мыши; MUT – трансгенные мыши.
Рисунок 5. Аномальное Социальное Взаимодействие Немутантных Мышей и Мышей Mecp2308/y
(А) Когда немутантные мыши (n = 9) и трансгенные мыши (n = 9) сталкивались друг с другом в ходе теста с трубкой, немутантные мыши отступали в большинстве случаев.
(В) В тесте «чужак-резидент» немутантные и трансгенные мыши-резиденты инициировали одинаковое количество различных типов взаимодействия в течение пятиминутного тестового периода. Однако у немутантных мышей-чужаков наблюдалось уменьшенное число вертикальных стоек и обнюхивания по отношению к трансгенным мышам.
(С) Немутантные и трансгенные мыши-резиденты взаимодействовали с чужаками в течение одинакового периода времени в ходе теста, однако общее время взаимодействия, инициированного чужаками, было меньше, если резидентом являлся мутант.
Сокращения: WT – немутантные мыши; MUT – трансгенные мыши.
Чтобы проанализировать социальное взаимодействие, мы провели тест «чужак-резидент», который был использован для оценки агрессивного поведения у мышей (Miczek, 1979). Очень низкий уровень агрессии наблюдался у мышей с изученной наследственностью (C57BL/6J x 129/SvEv), когда немутантная мышь-чужак помещалась в клетку одиночной немутантной мыши или трансгенной мыши, что позволило, таким образом, анализировать социальное взаимодействие. Типы взаимоотношений, представленные у немутантных и трансгенных мышей-резидентов по отношению к чужакам не отличались (Рисунок 5B). Общее время, затраченное на взаимодействие с чужаком, у немутантных мышей и трансгенных мышей также существенно не различалось (Рисунок 5С). Интересно, тем не менее, что хотя немутантные чужаки инициировали схожие типы взаимодействия с немутантным и трансгенными мышами-резидентами, они значительно реже инициировали вертикальные стойки и обнюхивание по отношению к трансгенным мышам (Рисунок 5В). Что более важно, общее время, которое затратили чужаки на взаимодействие с мышами Mecp2308/y, было значительно меньше времени, затраченного на взаимодействие с немутантными мышами (Рисунок 5С).
У Трансгенных Мышей Наблюдается Нормальная Условнорефлекторная Реакция Страха и Пространственное Обучение.
Чтобы определить возможные связи с когнитивными расстройствами у больных с синдромом Ретта, мы оценили поведение мышей Mecp2 и однопометных немутантных мышей в ходе теста на формирование условнорефлекторного страха и теста водного лабиринта Мориса. В ходе теста на формирование условнорефлекторного страха мышей помещают в тестовую камеру и вырабатывают у них ассоциации с шумом 80 дБ, который служит условным раздражителем (CS), с электрокожным раздражением лап средней силы. У мышей Mecp2308/y наблюдался уровень замирания, сопоставимый с уровнем немутантных мышей, как при помещении их в тестовую камеру без условного раздражителя (контекстный тест) (p = 0,70), так и при помещении их в стандартную клетку при наличии условного раздражителя (CS-PreCS) (p = 0,85) (Рисунок 6A). Тест водного лабиринта Мориса требует от мышей нахождения скрытой платформы в бассейне с водой. В ходе данного теста трансгенные мыши демонстрировали нормальный латентный период нахождения платформы, что показывает, что пространственное обучение у них не нарушено (p = 0,30) (Рисунок 6B). Что важно, у трансгенных мышей наблюдалась нормальная скорость плавания в ходе всех восьми испытаний, что наводит на мысль о том, что, в целом, данные мыши не устают так быстро (Рисунок 6С). Данное обнаружение означает, что снижение активности со временем в ходе теста открытого поля (см. выше) не являлось результатом усталости. Когда платформу удалили из бассейна, было обнаружено, что мыши Mecp2308/y , как и немутантные мыши, оказывают предпочтение тому квадрату поля бассейна, где прежде находилась платформа, и пересекали точное местонахождение платформы с той же частотой (p = 0,98 и 0,85 для нахождения квадрата и пересечений платформы соответственно) (Рисунки 6D и 6E).
Патология
Патологический анализ показал, что масса тела и головного мозга мышей Mecp2308/y находилась в норме (нет данных). Текущий гистологический анализ трансгенных мышей не выявил выраженных морфологических отклонений в периферических тканях или ЦНС (нет данных). Кроме того, мы проанализировали картину окрашивания нескольких маркеров по иммуногистохимическому методу, которая оказалась измененной в мозговой ткани мышей с РТТ. Данные маркеры включали глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) для выявления реактивного глиоза, дендритные маркеры, белок, ассоциированный с микротрубочками 2 (MAP2) и провоспалительный нейропептид, вещество Р. Существенной разницы между немутантными и трансгенными мышами выявлено не было (нет данных).
У Мышей с Мутированным MeCP2 Определяется Гиперацетилирование Гистона Н3.
Хотя мутированный белок MeCP2 сохраняет свою нормальную локализацию в гетерохроматических районах (см. Рисунок 1D), его способность модифицировать структуру хроматина и/или подавлять транскрипцию все еще может быть нарушена. Чтобы определить, было ли нарушено привлечение гистон-деацетилазных комплексов, мы измерили уровень ацетилированного гистона Н3 у немутантных мышей и трансгенных мышей. У мышей Mecp2308/y был повышен уровень ацетилированного гистона Н3 в мозжечке, коре головного мозга и селезенке, при этом у всех был отмечен средний или высокий уровень MeCP2 (Рисунок 7). Что касается мозга, степень альтерации в коре была выше, чем в мозжечке, что соответствует относительному избытку MeCP2 в данных областях. Уровень MeCP2 высок в большинстве корковых нейронов, но варьирует в мозжечке, где он особенно низкий в зернистых клетках, а наиболее высокий – в церебральных нейронах (LaSalle et al., 2001; Shahbazian et al., 2002). В отличие от гиперацетилирования Н3 уровень ацетилированного гистона Н4 в мозжечке немутантных мышей и трансгенных мышей не отличался (нет данных). Чтобы выяснить, был ли гиперацетилирование Н3 связано с уровнем белка MeCP2, мы исследовали уровень ацетилированного Н3 в печени, ткань которой отличается чрезвычайно низким уровнем MeCP2. Анализ ядерных экстрактов из печени и коры немутантных мышей и Mecp2 трансгенных мышей показал, что ацетилирование Н3 осталось неизмененным в печени, в то время как в коре разница была существенная (Рисунок 7).
Рисунок 6. У Mecp2 Трансгенных Мышей не Было Выявлено Аномалий в Парадигмах Обучения и Запоминания.
(А) В ходе теста на формирование условнорефлекторного страха Mecp2 трансгенные мыши (n = 24) и немутантные мыши (n = 19) научились связывать окружающую среду (контекст) и условный раздражитель (CS) с элктрокожным раздражением лап, что определялось по замиранию.
(В) В ходе теста водного лабиринта Мориса показатели времени, требующееся для нахождения платформы, погруженной в воду, у немутантных мышей и трансгенных мышей были схожими.
(С) Скорость плавания трансгенных мышей была также сопоставима со скоростью немутантных мышей.
(D и E) При удалении платформы из бассейна с водой немутантные мыши и трансгенные мыши отыскивали квадрат бассейна, где прежде находилась платформа, и пересекали точное местонахождение платформы с одинаковой частотой. Сокращения: WT – немутантные мыши; MUT – трансгенные мыши.
Рисунок 7. Тканеспецифичное Гиперацетилирование Гистона Н3 у Мышей Mecp2308/y.
Анализ белков, экстрагированных кислотой, показал повышенный уровень ацетилирования гистона Н3 в мозжечке, селезенке и коре Mecp2 трансгенных мышей. При анализе ядерных экстрактов выяснилось, что ацетилирование Н3 осталось неизмененным в печени, ткань которой отличается очень низким уровнем MeCP2, в то время как в коре наблюдалась разница. Для каждого указанного типа ткани было независимо проанализировано от трех до шести мышей каждого генотипа.
Сокращения: WT – немутантные мыши; MUT – трансгенные мыши.
Обсуждение
Для построения модели синдрома Ретта у самцов мышей мы заместили аллель Mecp2 у немутантных мышей аллелем, кодирующим процессированный белок. Как ожидалось, исходя из данных о мутациях MECP2 у мужчин, мыши с формой мутации более легкой, чем нулевой аллель, избежали преждевременной смерти, вызываемой отсутствием MeCP2, что позволило нам проанализировать поведенческий фенотип и прогрессирование заболевания. Мыши Mecp2308/y не отличались от немутантных мышей до возраста 5-6 недель, однако после этого у них развивались многочисленные неврологические признаки, напоминающие симптомы синдрома Ретта. Тремор тела и моторные нарушения впервые были отмечены в возрасте около 2 месяцев. У мышей Mecp2308/y также наблюдались парциальные припадки с сильными миоклоническими разрядами. Многочисленные типы припадков, включая парциальные и генерализованные, отмечались у пациентов с РТТ (Glaze et al., 1998; Steffenburg et al., 2001). Вероятно, наиболее удивительным было то, что у трансгенных мышей отмечались стереотипные движения передних лап и сжимание их, когда мышей подвешивали за хвост; подобное поведение отличается от сжимания передних лап, наблюдаемого у многочисленных мышиных моделей неврологических заболеваний. Сходство этих стереотипных движений передних конечностей со сжиманием рук у пациентов с РТТ является примечательным, поскольку это позволит исследовать анатомическую и молекулярную базу данного специфического поведения.
Пациенты с синдромом Ретта утрачивают приобретенные моторные навыки, такие как целенаправленное использование рук и ходьба. Молодые мыши Mecp2308/y показывали хорошие результаты в ходе тестов на моторные функции, однако с возрастом (начиная с 8-9 недель) они утрачивали способность висеть на подвешенной проволоке, держаться на вертикальном шесте, удерживаться на горизонтальном деревянном штифте и ходить по вращающемуся стержню без захватов. Вероятно, данные отклонения не являются следствием мышечной слабости или усталости, поскольку сила схвата передних конечностей была нормальной, и трансгенные мыши плавали со скоростью, аналогичной скорости немутантных мышей. Прогрессирующая моторная дисфункция и непроизвольные движения, такие как тремор и стереотипные движение передних конечностей предполагают в своей основе наличие двигательных нарушений. Кроме того, моторная дисфункция у этих мышей была прогрессирующей: в возрасте 8-9 недель мыши удерживались на штифте в течение максимального для этого теста времени, однако в ходе более сложного теста с проволокой их показатели ухудшались. В возрасте 35-36 недель они падали со штифта значительно раньше, чем немутантные мыши. У самок мышей болезнь протекала гораздо легче и варьировалась, вероятно, вследствие различий в паттерне инактивации Х-хромосомы.
В ходе теста открытого поля мыши Mecp2308/y проходили меньшее расстояние, тратили меньше времени на ходьбу и делали меньше вертикальных стоек, чем немутантные мыши. Такое поведение согласуется со сниженной активностью пациентов с синдромом Ретта и сходно с гипоактивностью, наблюдаемой при гетерозиготной нулевой мутации Mecp2 (Guy et al., 2001). Интересно, что в течение первых десяти минут теста у мышей Mecp2308/y отмечался нормальный уровень двигательной активности. Причиной этого может служить новизна тестового окружения, что вызывает сначала повышенную активность, однако, с течением времени, этот эффект пропадает и мыши возвращаются к базовому уровню активности. И наоборот, мыши могут быстро уставать, но, исходя из вышеуказанных причин, это менее вероятно. Между тем как время, которое немутантные мыши провели в центре открытого поля, возросло, у мышей Mecp2308/y этого не наблюдалось. Поведение трансгенных мышей указывает на неспособность привыкнуть к новому окружению и наводит на мысль о повышенном уровне тревожности (Paylor et al., 1998). Хотя мыши Mecp2308/y, по-видимому, свыклись, в некоторой степени, с обстановкой открытого поля, судя по снижению их активности с течением времени, общий уровень тревожности у них оставался более высоким, чем у немутантных мышей.
В тесте с трубкой на социальное взаимодействие немутантные мыши обычно отступали при столкновении с мышами Mecp2308/y. Когда мы провели дальнейшее исследование в рамках парадигмы «чужак-резидент», мы выяснили, что хотя поведение немутантных и трансгенных резидентов было сходным по отношению к вновь прибывшим чужакам, немутантные чужаки затрачивали меньше времени на взаимодействие с трансгенными резидентами, чем с немутантными резидентами. Далее, при проведении обоих тестов немутантные животные активно избегали трансгенных животных. Как было упомянуто ранее, шерсть мышей Mecp2308/y со временем становилась более жирной и взъерошенной. Это может указывать на недостаточную чистку или повышенную внешнюю секрецию, что могло отталкивать немутантных животных. И наоборот, немутантные мыши могут пугаться дрожащего, неуклюжего и тревожного противника. Необходимо провести дополнительные испытания, чтобы выявить основы этого аберрантного социального взаимодействия, наблюдаемого в ходе этих экспериментов.
Во время наших испытаний двух парадигм обучения и запоминания мы не обнаружили каких-либо отклонений у мышей Mecp2308/y в тестируемых возрастах (до 5 месяцев). Это не исключает возможности, что могут иметься другие когнитивные ухудшения. Глубокие моторные нарушения приводят к тому, что проведение теста на интеллект у людей с синдромом Ретта фактически невозможно, таким образом, когнитивные нарушения, поражающие этих людей, неизвестны. Тем не менее, некоторые когнитивные ухудшения у людей известны: даже женщина, которую мутация MECP2 пощадила – ей удалось благополучно избежать инактивации Х-хромосомы – обладала неспособностью к обучению средней степени. Следующей задачей является определение истинной сущности когнитивных нарушений, как у мышей, так и у людей. Необходимо проводить дальнейшие испытания, чтобы изучить другие парадигмы обучения и дополнительно исследовать социальное поведение этих мышей. Мыши Mecp2308/y имели нормальную массу тела, мозга и размер нейронов. Это очевидное расхождение с уменьшенным размером мозга, наблюдаемое при синдроме Ретта не удивительно, поскольку первые признаки заболевания у пациентов с синдромом Ретта отмечаются в возрасте между 6 месяцами и двумя годами, в период, когда размер головы все еще растет нормально. У мышей Mecp2308/y симптомы не отмечались до шестинедельного возраста, когда рост головы практически завершен. На гистологическом уровне мозг мышей Mecp2308/y был сходен с мозгом пациентов с РТТ, где не наблюдалось существенных изменений общей морфологии мозга. Также не отмечалось состоятельных изменений уровня некоторых мозгоспецифичных маркеров. Ограниченное количество патологических данных при синдроме Ретта можно частично объяснить тем фактом, что основные структурные изменения нейронного развития имели место до манифестации нарушения. Следовательно, какие-либо морфологические нарушения мозга при синдроме Ретта относительно незаметны. Например, было выявлено, что древовидное разветвление пирамидальных нейронов было немного, но достоверно снижено при РТТ, но только в определенных отделах коры (Armstrong et al., 1995). В настоящее время проводятся подобные исследования мышей Mecp2308/y, однако отсутствие состоятельных и заметных морфологических изменений в мозге при синдроме Ретта подчеркивает необходимость понимания молекулярных изменений, которые происходят при дисфункции MeCP2.
Хотя процессированный белок MeCP2 у мышей Mecp2308/y нормально локализуется в гетерохроматических хромосомных областях, ясно, что другие аспекты его функционирования нарушаются. Анализируя состояние ацетилирования гистона у мышей Mecp2308/y, мы обнаружили тканеспецифичное ацетилирование гистона Н3, которое варьировалось пропорционально уровню экспрессии MeCP2. И наоборот, ацетилирование гистона Н4 было нормальным в мозжечке. Данный результат приводит к мысли, что, хотя процессированный белок MeCP2 сохраняет свой домен транскрипционной репрессии, он неспособен привлекать гистон-деацетилазные комплексы, возможно потому, что для стабилизации взаимодействия с такими факторами требуется карбоксильный конец белка. В условиях in vitro ассоциация MeCP2 с корепрессорами c-Ski и N-CoR сохраняется, когда он процессируется непосредственно за TRD (в аминокислоте 309) (Kokura et al., 2001); также, в клетках только TRD достаточно для подавления транскрипции гена-репортера (Nan et al., 1997). Таким образом, представляется, что требования к связыванию комплексов корепрессоров in vivo и уровню физиологического белка являются более строгими.
Наши данные показывают, что интактный MeCP2 является важной детерминантой ацетилирования гистона Н3. Наличие гиперацетилирования гистона Н3 в мозговой ткани Mecp2 трансгенных мышей не соответствует наблюдению, что гистон Н4, а не Н3, гиперацетилируется в клеточной линии лимфобластов у пациентов с РТТ (Wan et al., 2001). Однако некоторые другие исследования показали, что метилирование ДНК и связывание MeCP2 связаны с деацетилирование гистона Н3, а не Н4 (Gregory et al., 2001; Lorincz et al., 2001; Nguyen et al., 2001). На основании этих данных и наших результатов можно предположить, что MeCP2 может преференциально привлекать гистон-деацетилазы, что говорит в пользу гистона Н3 в качестве субстрата, хотя данная преференция может зависеть от типа клеток. На культуре дрожжей было показано, что гистон-деацетилазы могут проявлять различные специфичности для определенных гистонов (Bjerling et al., 2002). Выявление гистон-деацетилаз, которые специфично взаимодействуют с MeCP2 в мозге может оказаться многообещающим.
Гиперацетилирование гистона в селезенке трансгенных мышей предполагает, что в селезенке присутствуют начальные молекулярные последствия дисфункции MeCP2 (т.е. транскрипционные изменения), но они могут не оказывать того пагубного воздействия, которое они оказывают на нейронную ткань. Поскольку MeCP2 экспрессируется в большинстве клеток коры, эта ткань может отразить наилучшим способом последствия дисфункции MeCP2. Принимая во внимание двух-трех кратное повышение ацетилирования Н3 в этой ткани, в структуре хроматина может иметь место генерализированное изменение, которое, в свою очередь, может повысить доступность ДНК транскрипционным регуляторам. Значительное изменение в ацетилировании гистона у мышей Mecp2308/y соответствует экстенсивному связыванию MeCP2 с хромосомами. Тем не менее, озадачивает тот факт, что изменения, которые вероятно ведут к транскрипционным альтерациям во многих генах, имеют результатом специфический и воспроизводимый нейропсихический фенотип. Возможно, что уровень пертурбации ацетилирования гистона недостаточен для изменения нормальной структуры хроматина во многих областях, однако в отдельных областях хроматина уровень ацетилирования может быть критическим для регулирования определенных генов.
При рассмотрении различий между мышами с нулевой мутацией Mecp2 и Mecp2308/y мутантами, выясняется, что у мышей с нулевой мутацией моделируется тяжелое неврологическое заболевание, сопоставимое с заболеванием, наблюдаемым у мужчин с более тяжелыми мутациями MECP2 (Hoffbuhr et al., 2001; Villard et al., 2000; Wan et al., 1999), в то время как у мышей Mecp2308/y моделируется фенотип с классическим синдромом Ретта. Построив систему моделей, воспроизводящую многие симптомы синдрома Ретта без разрушающих последствий инактивации Х-хромосомы, мы можем обратиться к аспектам патогенеза, которые остались невыясненными. Обнаружение того факта, что гипреацетилирование гистона Н3, происходящее у этих мышей подтверждает идею о том, что нарушение функции MeCP2 может привести к изменению структуры хроматина и экспрессии гена. Идентификация генов, неправильно регулируемых при наличии дисфункции MeCP2, может обеспечить понимание нейронной специфичности РТТ, а также объяснить, почему нарушаются в особенности конкретные функции мозга. Знание молекулярных явлений, лежащих в основе конкретных стадий этого прогрессирующего фенотипа может, в итоге, привести к пониманию функции генов, принимающих участие в регулировании моторной функции, контроля верхних конечностей, непроизвольных движений, судорог и тревожности.
Методика Эксперимента
Таргетирование Гена и Разведение Мышей
Геномные последовательности для вектора направленного воздействия были получены из клона геномной библиотеки, содержащего 18 тысяч нуклеотидов (т.н.) гена Mecp2 из интрона 2 через 3' нетранслируемую область (UTR) экзона 4. 5' область гомологии у таргетинг-вектора состояла из 4,3 т.н. фрагмента Mecp2, соединяющего изнутри интрон 2 и кодон 308 в экзоне 4. За этим последовал внутрирамочный терминирующий кодон для прекращения транскрипции и кассета, резистентная к неомицину (neoR), фланкированная loxP-сайтами для последующего удаления Cre рекомбиназой. 6,9 т.н. фрагмент геномной последовательности Mecp2, начиная с 12 нуклеотидов после эндогенного терминирующего кодона и сохраняя все известные сигналы полиаденилирования, выступал в качестве 3' области гомологии. После проведения электропорации эмбриональных стволовых клеток (ES) генетического окружения 129S5/SvEvBrd у мыши, 96 G418-резистентных клонов были изолированы и проверены на наличие должных явлений рекомбинации посредством саузерн-блоттинг анализа. Вкратце, геномная ДНК была расщеплена EcoRV и перемещена на мембрану GeneScreen Plus (NEN Life Science Products). Данный блоттинг-анализ был проведен независимо с участием 1,3 т.н. геномного фрагмента EcoRI, располагающегося в 3’-5’ направлении от геномных последовательностей в таргетинг-векторе и 764 пар нуклеотидов фрагмента Mbil, располагающегося в 5’-3’ направлении. 32% клонов ES-клеток показали результаты, ожидаемые для явления гомологичной рекомбинации. Три из этих клонов были инъецированы в бластоцисты C57BL/6J, которые затем были имплантированы псевдобеременным самкам. Родились пять самцов гибридных мышей, которые были скрещены с самками C57BL/6J и 129/SvEv, у которых родились гетерозиготные самки со смешанной и чистой наследственностью соответственно. Гетерозиготные самки затем были скрещены с самцами C57BL/6J или 129/SvEv, и произвели немутантных самцов и самок, гетерозиготных самок и гомозиготных самцов, которых использовали для последующих экспериментов.
Данные электроэнцефалографии (ЭЭГ) Мышам была сделана анестезия с применением Авертина (Avertin) и имплантированы серебряные проволочные электроды (0,005 в диаметре), припаянные к микроминиатюрному коннектору в субдуральное пространство с двух сторон над лобной и теменной корой. Показания ЭЭГ записывались ежедневно в виде 2-24 часовых промежутков времени, выбранных методом случайного отбора в течение 7-10 дней с использованием цифрового видео/ЭЭГ записывающего устройства (Stellate Systems). Все записи производились, как минимум, через 24 часа после проведения хирургического вмешательства, при свободном передвижении мышей по тестовой клетке.
Иммуноблоттинг
Мыши были забиты посредством дислокации шейных позвонков, после чего неповрежденные ткани были удалены и гомогенизированы в экстракционном буфере (100 mM Tris [pH 6,8], 2% ДСН, 25 mM ДТТ, смесь ингибиторов пептидазы 5X [Roche Molecular Biochemicals]) гомогенизатором Даунса. Общий уровень белка был подсчитан модифицированным методом Бредфорда (Bio-Rad Protein Assay) и 100 мкг белка было загружено на 8% ДСН-полиакриламидный гель и сепарировано посредством электрофореза. Белки были перенесены с геля на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell). Блоты были блокированы в 5% обезжиренном сухом молоке Blotting Grade ингибитором (Bio-Rad) в растворе Tris буфера с применением 0.1 % Tween-20 (TBS-T) в течение 1 часа. Затем мембраны были инкубированы либо антителами к MeCP2 (Shahbazian et al., 2002), разбавленными 1:1000, либо антителами к GAPDH (Advanced Immunochemical Inc.), разбавленными 1:20 000 в блокирующем растворе. Мембрана была промыта три раза по пять минут в TBS-T, а затем инкубирована блокирующим раствором, содержащим антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma), разбавленными 1:5000 в течение 45 минут. Избыток антител был смыт тремя промываниями в TBS-T по пять минут, и конъюгаты антител визуализировались с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECU Amersham Life Science).
Поведенческие Тесты
Подопытные Животные
Для всех поведенческих анализов использовались самцы мышей со смешанной наследственностью (C57BL/6J и 129/SvEv) (как указано выше), за исключением случаев, оговоренных отдельно. Одна группа, состоящая из однопометных немутантных (n = 10) и трансгенных (n = 12) особей тестировалась в возрасте 3 месяцев, а другая группа, состоящая из однопометных немутантных (n = 9) и трансгенных (n = 12) особей тестировалась в возрасте 5 месяцев. Поскольку показания двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) не выявили результатов, связанных с возрастом, данные, полученные в двух группах, были объединены и проанализированы вместе. В каждом тесте были использованы обе возрастные группы, за исключением случаев, оговоренных отдельно.
Тест Вертикальной Оси
Мыши помещались на один конец стержня, покрытого тканевой лентой (1,9 см в диаметре, 43 см длиной). Затем положение стержня менялось на вертикальное; время, в течение которого мыши удерживались на стержне, оценивалось в баллах следующим образом: падение до того, как стержень достигал угла 45° = 0; падение до того, как стержень достигал угла 90° = 1; падение через 0-10 с = 2, 11-20 с = 3,21-30 с = 4,31-40 с = 5,41-50 с = 6,51-60 с = 7; мышь удерживалась наверху в течение 60 с, затем слезала вниз до половины стержня = 8; мышь слезала к нижнему концу стержня = 9; мышь доходила до конца стержня и слезала с него через 51-60 с = 10, 41-50 с = 11, 31-40 с = 12, 21-30 с = 13, 11-20 с = 14,1-20 с = 15. Для измерения статистической значимости использовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
Тест с Подвешенной Проволокой
Мыши подвешивались за передние лапы на двухмиллиметровой проволоке, и отмечалось время, в течение которого они удерживались на проволоке. Статистическая значимость определялась при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
Анализ Силы Схвата
Сила схвата передних конечностей измерялась при помощи измерительного прибора Grip Strength Meter (Ugo Basile). Мышей брали за хвост и позволяли им схватиться передними лапами за трапецеидальный прут. Когда мышь хваталась за прут обеими лапами, ее оттаскивали от прута до тех пор, пока мышь не отпускала прут. Цифровой измеритель показывает силу натяжения (в граммах), оказываемого мышью на прут. Данные анализировались методом однофакторного дисперсионного анализа.
Стандартный и Модифицированный Тест Вращающегося Стержня
Группа трехмесячных животных прошла стандартный тест вращающегося стержня. Мышей поместили в аппарат с ускоряющимся вращающимся стержнем (Ugo Basile) и провели восемь испытаний (четыре испытания в течение двух последовательных дней) с 30-60 минутным отдыхом между испытаниями. Каждое испытание длилось максимально 5 минут, в течение которых скорость стержня линейно увеличивалась с 4 до 40 об/мин. В ходе каждого испытания фиксировалось время, за которое каждая мышь падала со стержня. Если мышь удерживалась на стержне и прокручивалась на 360°, это время отмечалось, а время второго оборота фиксировалось как момент, в который мышь падала со стержня.
В ходе модифицированного теста вращающегося стержня была проанализирована группа мышей в возрасте пяти месяцев. Для данного теста стержень был покрыт клейкой лентой для исключения возможности захвата. Мышей помещали на стержень, вращающийся в направлении вперед или назад, и провели два испытания с, как минимум, тридцатиминутным интервалом для отдыха между испытаниями. Данные были проанализированы методом двухфакторного (генотип х испытание) дисперсионного анализа с повторными измерениями.
Тест со штифтом
В данном анализе была использована группа трехмесячных однопометных немутантных (n = 6) и трансгенных (n = 7) особей. Мышей помещали на центр горизонтально расположенного штифта (диаметром 0,9 см), затем отмечалось время, в течение которого они оставались на штифте. Если мышь ходила по штифту и слезала с него, ее возвращали обратно на штифт. Испытания длились в течение двух минут максимально. Данные были проанализированы методом U-критерия Манна-Уитни.
Тест Открытого Поля
Мышей помещали в центр открытой площадки (40 х 40 х 30 см). Активность измерялась при помощи компьютерной оптической системы мониторинга активности животных Digiscan (RXYZCM, Acuscan). Каждый сеанс теста длился 30 минут, интервал сбора данных составлял десять минут. Данные были проанализированы методом двухфакторного (генотип х десятиминутный интервал) дисперсионного анализа с повторными измерениями. Существенные взаимодействия затем анализировались с помощью тестов простых результатов (simple effect test).
Тест с Трубкой
В ходе теста с трубкой мышей помещали в противоположных концах цилиндрической акриловой трубки (диаметром 3,5 см), при этом отмечалась мышь, которая отступала назад. Процентное отношение отступлений подсчитывалось на основе общего количества встреч. Были использованы девять немутантных и девять трансгенных мышей из группы пятимесячных животных. Каждая мышь прошла тестирование против семи мышей противоположного генотипа из различных клеток. Данные были проанализированы методом U-критерия Манна-Уитни.
Тест «Чужак-Резидент»
Восемь немутантных и восемь трансгенных мышей со смешанной наследственностью (C57BL/6J и 129/SvEv) были посажены в индивидуальные клетки в возрасте шести месяцев за четыре недели до тестирования. Группа из восьми мышей 129/SvEv, которые были поселены вместе, выступали в качестве чужаков. Тестирование проводилось в течение двух дней, при этом половина немутантных и трансгенных резидентов были протестированы в первый день, и вторая половина - на второй день. Половина чужаков были помещены к немутантным мышам в первый день и к трансгенным мышам – на второй день, а другая половина группы подверглась тестированию в обратном порядке. В целях тестирования чужак помещался в клетку немутантного или трансгенного резидента на пять минут, при этом велась видеозапись. Затем на основании видеозаписей подсчитывалось количество различных типов социальных взаимодействий, а также общее время, затраченное на взаимодействие, инициированное как резидентом, так и чужаком. Данные были проанализированы с помощью непарного критерия Стьюдента (StatView 5.0.1).
Тест на Формирование Условнорефлекторного Страха
Тесты проводились в испытательной камере с решетчатым полом, который мог продуцировать электрошок. В исходном положении мышей помещали в камеру и не беспокоили в течение двух минут. В качестве условного раздражителя (CS) служил белый шум, который имел место в течение 30 секунд, сопровождаемый электрокожным раздражением лап средней силы (2 с, 0,5 мA), выступающее в качестве безусловного раздражителя (US). Через две минуты была проведена еще одна пара CS-US. Через 30 секунд мышь извлекали из камеры и возвращали в ее клетку. Фиксировалась такая реакция как бег, подпрыгивание и издавание звуков в ответ на электрошок. Через 24 часа каждую мышь вернули в испытательную камеру, при этом было зафиксировано замирание в течение пяти минут (контекстный тест). Для слухового CS теста внешние и контекстуальные стимулы были изменены: для изменения формы камеры и пространственных ориентиров в камеру был помещен черный плексигласовый треугольник, красное освещение было заменено белым, решетчатый проволочный пол был покрыт черным плексигласом, а также был добавлен экстракт ванили для изменения запаха. Слуховой CS тест состоял из двух фаз. В первой фазе (пре-CS) фиксировалось замирание в течение трех минут без CS. Во второй фазе подавался звуковой условный раздражитель, замирание фиксировалось в течение еще трех минут. Замирание фиксировалось экспериментатором, который не знал, какой генотип имеют мыши. Замирание засчитывалось каждые десять секунд в ходе тренировки и тестирования. Количество интервалов с замиранием было переведено в величину, выраженную в процентах. Данные контекстного теста и теста на условный рефлекс были проанализированы методом однофакторного дисперсионного анализа.
Водный Тест Мориса
Мышей обучали нахождению скрытой платформы в круглом бассейне (диаметром 1,38 м) с водой. Каждая мышь проходила восемь тренировочных испытаний в день, блоками по четыре испытания в течение четырех последующих дней. Фиксировалось время, за которое мышь устанавливала местонахождение платформы (латентный период освобождения и пройденное расстояние). После последнего испытания был проведен пробный тест: платформа была удалена, при этом фиксировалось время, которое мышь затрачивала на изучение каждого квадрата (время изучения квадрата) и количество раз, которое мышь пересекала удаленную платформу (пересечение платформы). Данные по латентному периоду освобождения и пройденному расстоянию были проанализированы методом двухфакторного (генотип х блок испытаний) дисперсионного анализа с повторными измерениями. Данные пробного теста были проанализированы отдельно методом однофакторного дисперсионного анализа и сравнительных критериев Ньюмана-Кейла. Однофакторный дисперсионный анализ был применен для сравнения данных о времени изучения квадрата и пересечения платформы в обучающем квадрате только между немутантными и трансгенными мышами.
Иммуногистохимия и Гистология
Эмбрионы и ткани мышей были зафиксированы либо посредством транскардиальной перфузии 4% формальдегида, разведенного в ФСБ-растворе, либо посредством погружения в 10% формалин, затем они были промыты и были сделаны срезы. Репрезентативные срезы коры головного мозга, подкорковых узлов, мозжечка, стволовой части мозга и спинного мозга были обезвожены и пропитаны парафином. Были сделаны срезы толщиной 5 мкм, установлены на «позитивные» предметные стекла, антигены восстановлены в лимонной кислоте (pH 6,0) в течение трех пятиминутных нагревов СВЧ-импульсами. Расщепление ядра было достигнуто с помощью протеиназы К. Для тканей мышей был использован MECP2N15 (Shahbazian et al., 2002) или анти-MeCP2 (Upstate Biotechnology) в разведении 1:100 в течение трех ночей при температуре 4°C. Биотинилированные вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика применялись из набора ABC-Elite kit (Vector Laboratories). В качестве хромогена использовался Новаред.
Анализ Ацетилирования Гистонов
Ткани были гомогенизированы в 500 мкл лизирующего буфера (10 mM HEPES [pH 7,8], 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM ДТТ, 1,5 mM ФМСФ, 5mM маслянокислого натрия, смесь ингибиторов пептидазы 1X (Roche Molecular Biochemicals). В лизат была добавлена соляная кислота до конечной концентрации 0,2 N и проведена инкубация при температуре 4°C в течение 30 минут. Лизат был центрифугирован при 11 000 X g в течение 10 min при температуре 4°C, проведен диализ супернатанта при температуре 4°C 0,1 М уксусной кислотой сначала в течение ночи, а затем в течение 1 часа. Затем был проведен диализ против воды в течение 1 часа, 3 часов и затем в течение ночи. Все процедуры диализа проводились против буфера, объем которого приблизительно в 400 раз превышал объем лизата.
Для изоляции ядерного экстракта от коры и печени ткани были гомогенизированы в 800 мкл лизирующего буфера А (25 mM Tris-HCI [pH 7,5], 50 mM KCl, 2 mM MgCl, 1 mM ЭДТК, 5 mM ДТТ, и 5 mM маслянокислого натрия). Ядра были осажены центрифугированием при 1 700 x g при температуре 4°C и промыты в лизирующем буфере А. Экстракция ядерных белков высококонцентрированным солевым раствором была проведена посредством инкубации ядер в буфере В (25 mM Tris-HCI [pH 7.5], 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM ЭДТК, 1 mM ДТТ, 5 mM маслянокислого натрия, смесь ингибиторов пептидазы 1X [Roche Molecular Biochemicals], и 25% сахарозы) Лизат был центрифугирован при 8000 x g при температуре 4°C в течение 10 минут, супернатант (ядерный экстракт) использован для анализа.
Концентрация белка были измерена с помощью модифицированного анализа Бредфорда (Bio-Rad Protein Assay) и верифицирована окрашиванием кумасси с предварительным электрофорезом в ПАГ в присутствии ДСН. 20 мкг были использованы для вестерн-блоттинга, зондированные антиацетилгистоновыми Н3 кроличьими поликлональными, антиацетилгистоновыми Н4 кроличьими поликлональными или антигистоновыми Н3 мышиными моноклональными антителами (Upstate Biotechnology).
Благодарность
Авторы благодарят Калеба Дейвиса за техническую поддержку ЭЭГ/видеомониторинга. Данные исследования осуществлялись при поддержке аспирантской стипендии Национального института здоровья США (НИЗ) Моне Д. Шахбазян (MH12555-02), гранта НИЗ США Худе И. Зогби (P01 HD40301) и гранта НИЗ США Медицинскому Центру Изучения Умственной Отсталости Колледжа Бэйлора (HD24064). Худа И. Зогби является исследователем Медицинского Института Говарда Хьюза.
